過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建
基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)包括目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選。您只需提供目的基因的cDNA質(zhì)粒或目的序列信息和需要構(gòu)建的細(xì)胞系，我們將按照您的要求完成目的基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建和檢測(cè)，提供給您高質(zhì)量的基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。
服務(wù)特點(diǎn)
1、多種不同啟動(dòng)子和標(biāo)簽的慢病毒表達(dá)載體可供選擇。
2、采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建，基因整合穩(wěn)定。
3、根據(jù)您的需要可以提供經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的多克隆細(xì)胞系或者高品質(zhì)的單克隆細(xì)胞系。
您需提供的資料
1.客戶(hù)提供目的基因的序列，如果提供模板，請(qǐng)告知載體、酶切穩(wěn)點(diǎn)等信息；
2.若實(shí)驗(yàn)材料為原代細(xì)胞或者特殊培養(yǎng)的細(xì)胞，請(qǐng)先咨詢(xún)；
3.公司默認(rèn)提供病毒滴度為1x107-1x108TU/ml,規(guī)格1ml；
4.目的蛋白的功能驗(yàn)證另外收費(fèi)。
我們提交的內(nèi)容
1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：
A 慢病毒載體構(gòu)建報(bào)告及測(cè)序結(jié)果。
B 細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
C 目的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。
2、產(chǎn)品內(nèi)容：
A 已構(gòu)建慢病毒載體；
B 多克隆細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)提供目的基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株及EGFP表達(dá)對(duì)照細(xì)胞株各一株，單克隆細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)提供目的基因過(guò)表達(dá)單克隆細(xì)胞株2-3株及EGFP過(guò)表達(dá)對(duì)照細(xì)胞株一株。
原代細(xì)胞培養(yǎng)
將動(dòng)物各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA) 或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，麟美生物提原代培養(yǎng)服務(wù)供給您高質(zhì)量的原代細(xì)胞株。
服務(wù)特點(diǎn)
1、原代細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定(鑒定可提供流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR 、蛋白免疫印跡等多種方法檢測(cè))。
2、細(xì)胞傳代代數(shù)低(一般4代)，細(xì)胞狀態(tài)好，無(wú)污染。
3、根據(jù)您的需要可以提供多種原代培養(yǎng)的細(xì)胞。
您需提供的資料
1、詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織，并確定組織是由客戶(hù)提供還是本公司提供。
2、盡可能提供該原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件，或者由本公司摸索培養(yǎng)條件。
3、對(duì)于一些常見(jiàn)的原代培養(yǎng)組織，因?yàn)楸４孢\(yùn)輸?shù)牟槐憧赡軙?huì)降低原代培養(yǎng)的成功率，建議客戶(hù)選擇由本公司提供相應(yīng)的組織。
我們提交的內(nèi)容
提供凍存或處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株一瓶(細(xì)胞培養(yǎng)條件，圖片)。
干細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)
提供廣泛的干細(xì)胞產(chǎn)品，覆蓋胚胎和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），造血干細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞等干細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)。
服務(wù)特點(diǎn)
1、干細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定(鑒定可提供流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR 、蛋白免疫印跡等多種方法檢測(cè))。
2、細(xì)胞傳代代數(shù)低(一般4代)，細(xì)胞狀態(tài)好，無(wú)污染。
3、根據(jù)您的需要可以提供多種原代培養(yǎng)的細(xì)胞。
細(xì)胞增殖
一、流式熒光染色法
原理：
熒光染料CFSE， 即羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，這使得CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時(shí)，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到**代細(xì)胞中，這樣與**代細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度便會(huì)減弱至一半；以此類(lèi)推，分裂得到的第三代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度便會(huì)比**代細(xì)胞再次減弱。這種現(xiàn)象可以在488nm的激發(fā)光下，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，通過(guò)檢測(cè)到細(xì)胞熒光強(qiáng)度不斷的降低，進(jìn)一步分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。
實(shí)驗(yàn)步驟，以小鼠脾細(xì)胞為例：
1.取一只6-8周小鼠頸椎脫臼處死后，將其全部浸泡于75%酒精中；
2.在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌取出小鼠脾臟；
3.用無(wú)菌注射器內(nèi)芯研磨脾臟，盡量不殘留較大組織塊；再用3mlPBS沖洗后，將脾臟研磨液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至15mL離心管中，離心350g，5min；
4.棄上清后，加入2mL紅細(xì)胞裂解液，輕微吹打，裂解2min后加入等體積PBS終止裂解反應(yīng)，混勻后離心350g，5min；
5.棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀，并取10μL細(xì)胞液計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至2.0×106/ml；
6.提前將CFSE按照說(shuō)明書(shū)用DMSO配成5mM母液，并分裝儲(chǔ)存于-80冰箱，其工作濃度為0.5-25μM；
7、取部分細(xì)胞作為不染色組陰性對(duì)照，其他細(xì)胞加入CFSE溶液，使得終濃度為5μM，37°C避光孵育15min；
8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培養(yǎng)液，4℃，5min以中止染色；
9、棄上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培養(yǎng)液洗2次，*后用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，充分吹打成單細(xì)胞懸液，將上述細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,每孔105個(gè)細(xì)胞（陽(yáng)性對(duì)照用PHA刺激）；
10、37℃，5%CO2培養(yǎng)3天后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞488nm激光器檢查細(xì)胞增殖情況。
結(jié)果分析：用FlowJo分析細(xì)胞增殖
在FSC/SSC 上圈出目標(biāo)細(xì)胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏連體，使用 CFSE 單參看目標(biāo)細(xì)胞的增殖情況。以下圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)：細(xì)胞攝取染料后，信號(hào)強(qiáng)，在右邊（不分裂的話(huà)，就是那個(gè)桃紅色的峰），隨著細(xì)胞的每一次分裂，細(xì)胞內(nèi)染料的濃度被稀釋一倍，信號(hào)也減弱一半，以此類(lèi)推，由于細(xì)胞的分裂不同步，所以*后的結(jié)果是紅色的那些齒狀的峰。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：
CFSE的濃度國(guó)外報(bào)道從0.5uM-20uM都有，建議終濃度為2.5-5uM。濃度太低，細(xì)胞標(biāo)記的熒光強(qiáng)度不夠，太高了對(duì)細(xì)胞有毒性，且影響細(xì)胞增殖。標(biāo)記孵育時(shí)要經(jīng)常搖勻。
二、CCK-8法
實(shí)驗(yàn)原理：
CellCounting Kit-8（簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8）中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。
細(xì)胞周期
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。
一、BrdU法
1、原理
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過(guò)兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。
細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小時(shí)）
2、儀器、用品與試劑
2.1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2.2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
3、操作步驟
3.1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使*終濃度為10μg/ml。
3.2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3.3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
3.4、常規(guī)染色體制片（見(jiàn)第三部分：染色體技術(shù)）。
3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
3.7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
3.8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)**、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
3.9、計(jì)算：
（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H2 O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。
附： （1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
二、PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期
1、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。
2、加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過(guò)夜，或-20℃長(zhǎng)期固定（4℃過(guò)夜一般隔天就進(jìn)行檢測(cè)，如果想推遲幾天測(cè)，那就保存在-20℃，有資料說(shuō)-20℃可以保存一個(gè)月，個(gè)人建議盡量在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，有些實(shí)驗(yàn)是在不同時(shí)間點(diǎn)上收細(xì)胞，這時(shí)我就等*后一次固定完了一塊測(cè)，基本上也多在一周內(nèi)檢測(cè)完畢，沒(méi)有特地去比較保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）。
3、細(xì)胞染色
離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分鐘（PI我是直接用PBS配成工作濃度，然后加入細(xì)胞沉淀混勻，RNA酶現(xiàn)加，但有時(shí)不加發(fā)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)太大的影響） 。
4、流式分析
以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一般計(jì)數(shù)2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。
分析時(shí)，使用FL2-w和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細(xì)胞。
細(xì)胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個(gè)凋亡峰(也稱(chēng)sub-G0期),而如果分析時(shí)細(xì)胞窗口沒(méi)設(shè)置好，可能在*前面還有細(xì)胞碎片峰。
結(jié)果解讀
G0/G1期細(xì)胞占總的61.2%，峰位于橫座標(biāo)的45.76
G2/M期占13.07，峰位于橫座標(biāo)的91.43
S期占25.73
G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細(xì)胞，而G1期為2倍體細(xì)胞，比值為2）
峰的變異系數(shù)為4.54%（好）
細(xì)胞碎片為0.48%，細(xì)胞聚集體有0.06%。
總的細(xì)胞數(shù)（儀器檢測(cè)到的）為17525個(gè)，
在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)為17431個(gè)（即排除了碎片及聚集體后）
CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認(rèn)可了。
細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡或稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
一、實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 凋亡細(xì)胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2×106 /ml，備用。
2. 200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。
5. 加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。
6. 加入300 μl標(biāo)記緩沖液，立即上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)。
二、注意事項(xiàng)：
1. 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
用熒光顯微鏡觀(guān)察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上可見(jiàn)黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時(shí)結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細(xì)胞儀分析可檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。
RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)
細(xì)胞因子檢測(cè)
流式細(xì)胞檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位
激光共聚焦免疫熒光檢測(cè)
合肥合肥星肽生物科技有限公司 是致力于從事生命科學(xué)研究和提供高質(zhì)量的生物技術(shù)外包服務(wù)公司（CRO），主營(yíng)多肽及小分子等化合物定制合成，同時(shí)還擁有自己開(kāi)發(fā)的細(xì)胞株、菌株等產(chǎn)品，并承接相關(guān)的技術(shù)服務(wù)以及品牌（BIOLOGIX/巴羅克、DLAB/大龍）產(chǎn)品。
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天地合氣，萬(wàn)物自生。
